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LC/MS - Therapeutischen Drug Monitoring / Toxikologie

LC/MS - Therapeutischen Drug Monitoring / Toxikologie

Probenvorberetung

Googeln Sie mal unter dem Stichwort: „Therapeutisches Drug Monitoring“ (TDM). TDM steht für die Überwachung der Blutkonzentration von Medikamenten mit dem Ziel, die Therapie für den einzelnen Patienten effektiver und sicherer zu gestalten. Was sich dabei herauskristallisiert ist, dass sich in der Routine zunehmend - neben Immunoassays und konventionellen HPLC-Techniken – die LC-gekoppelte Tandem-Massenspektrometrie stärker etabliert. Der
Grund: damit ist es möglich, hoch empfindliche und hoch spezifische Multianalyt-Methoden für Pharmaka aus Bioflüssigkeiten, beim TDM vor allem aus Serum und Plasma, anzuwenden.

Googeln Sie mal unter dem Stichwort: „Therapeutisches Drug Monitoring“ (TDM). TDM steht für die Überwachung der Blutkonzentration von Medikamenten mit dem Ziel, die Therapie für den einzelnen Patienten effektiver und sicherer zu gestalten. Was sich dabei herauskristallisiert ist, dass sich in der Routine zunehmend - neben Immunoassays und konventionellen HPLC-Techniken – die LC-gekoppelte Tandem-Massenspektrometrie stärker etabliert. Der Grund: damit ist es möglich, hoch empfindliche und hoch spezifische Multianalyt-Methoden für Pharmaka aus Bioflüssigkeiten, beim TDM vor allem aus Serum und Plasma, anzuwenden. Wird die LC/MS routinemäßig als Analyseverfahren für Bioproben eingesetzt, so ist eines der großen Probleme der Matrixeffekt, der in der Regel die Ionenausbeute des Analyten verringert, also zur Ionensuppression führt. In Einzelfällen kann es auch zu einer erhöhten Ionenausbeute durch Störsubstanzen in der Matrix kommen. Welche Strategien lassen sich einsetzen, um Matrixeffekte zumindest zu verringern oder ganz zu eliminieren?

Neben der Verdünnung der Probe oder der Veränderung der chromatographischen Bedingungen zählt dazu vor allem die geschickte Abreicherung von Matrixbestandteilen, sodass sich die Analytik letztendlich quasi matrixunabhängig durchführen lässt. Um rationell Methoden zu entwickeln und eine robuste Qualitätssicherung im Routinebetrieb zu etablieren, sollte auf manuelle Arbeitsschritte verzichtet werden. Automatisierte Probenvorbereitung ist somit ein wichtiger Aspekt, um einen hohen Probendurchsatz zu generieren und die Wirtschaftlichkeit zu erhöhen. Wird die Probenvorbereitung betrachtet, so zeigt sich, dass vielfach Proteinfällungen mit diversen Fällungsreagenzien, wie z.B. Acetonitril oder Methanol-/Zinksulfatlösungen und nachfolgende Zentrifugation ausreichen, um eine richtige und präzise Analytik zu betreiben. Kommt es aber bei der LC-MS infolge von Matrixeffekten zu Ionensuppression oder Verschiebung der Retentionszeiten, sind spätestens dann aufwändigere Probenvorbereitungstechniken gefragt. Eine der wichtigsten Techniken, um die im Probenextrakt enthaltenen Verunreinigungen zu entfernen, ist die Festphasen-Extraktion. Diese hat sich in den vergangenen 25 Jahren so weit entwickelt, dass heute miniaturisierte 96-Well-Platten mit zuverlässigen, robusten Sorbentien im 10-mg-Maßstab verfügbar sind. Bei den Sorbentien haben sich insbesondere polymere Phasen als Träger der Wahl herausgestellt, weil sie im Gegensatz zu kieselgelmodifizierten Phasen eine höhere Analytkapazität aufweisen, pH-stabil sind und Fehler bei mangelhafter Konditionierung eher „verzeihen“ – kurzum robuster und einfacher in der Handhabung sind. Sie lassen sich prinzipiell in zwei große Gruppen unterteilen, in sogenannte „neutrale, nichtfunktionalisierte“ Polymere und Polymere mit Ionenaustauschfunktionalitäten. Vor allem die Letztgenannten stellen eine interessante Entwicklung dar, weil zwei unterschiedliche Retentionsmechanismen herangezogen werden können, um die unterschiedlichsten Analyte selektiv zu extrahieren und Matrixstoffe gezielt durch Waschschritte zu entfernen. Allen modernen polymeren Phasen für die Bioanalytik ist gemeinsam, dass sie sehr gut wasserbenetzbar sind und in einer geeigneten Partikelgrößenverteilung vorliegen, die sowohl eine gute Packungsdichte als auch gleichmäßige Flussrate gewährleistet. Waters hat mit der Einführung des Oasis HLB-Polymers (PS-DVB/N-Vinylpyrrolidon) vor gut 12 Jahren damit den Anfang gemacht, andere Hersteller wie Varian (Bond Elut Plexa), Phenomenex (Strata-X) und IST/Biotage (Evolute ABN) haben nachgezogen und bieten entsprechend vergleichbare Polymere an. Weiterhin ist allen gemeinsam, dass in der Regel für die Extraktion von sauren, neutralen und basischen Analyten eine Methode (bei unterschiedlichen pH-Wert-Einstellungen) genügt. Die Polymere unterscheiden sich aber hinsichtlich der erzielbaren Extraktreinheit, wobei vor allem die Abtrennung der die Ionensuppression verursachenden Proteine und Phospholipide relevant ist. Die Tabelle 1 gibt eine Übersicht über diese „neutralen“ Polymere wieder.

Die Oasis HLB-Methode ist stellvertretend wiedergegeben. Da insbesondere in der forensischen Toxikologie schon seit langem sogenannte Mixed-Mode-Phasen auf Kieselgelbasis eingesetzt werden (Tabelle 2, vor allem mit Kationenaustauschfunktion)

und routinetaugliche, bewährte Methoden existieren, wurden in den vergangenen Jahren die Polymere dahingehend weiterentwickelt, und es gibt heute eine Vielzahl von stark sauren Kationenaustauscherphasen zur Extraktion von schwach basischen Analyten sowie stark/schwach basische Anionenaustauschersorbentien zur Extraktionen von sauren Verbindungen. Ihr Kennzeichen ist vor allem die deutlich höhere Selektivität gegenüber den interessierenden Analyten und damit höhere erzielbare Extraktreinheit. Hierbei sei auf Tabelle 3 und auf die Methode mit Bond Elut Plexa PCX verwiesen.

Es gilt das zuvor Gesagte: eine einzige Methode genügt, um z.B. basische Verbindungen zu extrahieren. Wässrig-saure und neutrale Waschschritte mit organischen Lösemitteln dienen dazu, Salze, Proteine und unpolare Interferenzen vollständig aus der Matrix zu entfernen. Die kommerziellen Kationenaustauscherphasen unterscheiden sich – wenn auch nicht beträchtlich – in dem Reinheitsgrad des Extraktes und der Selektivität gegenüber polaren und unpolaren basischen Analyten. Was tut man nun, wenn die Reinigung des Extraktes nicht ausreicht? Es sei hier auf die Standardmethode nach de Zeeuw und Mitarbeiter verwiesen, der auf Basis von kieselgelgebunden Mixed-Mode-Kationenaustauschern die systematische toxikologische Analytik von biologischen Proben durchführte [1]. Durch gezielte Wahl von Wasch- und Elutionslösemitteln ließen sich für eine Vielzahl von therapeutisch und toxikologisch relevanten Arzneistoffen zufriedenstellende Wiederfindungen bei ausreichender Extraktreinheit erhalten. Da die Probenvorbereitung häufig zeitintensiv ist, interessiert in der Routine vor allem die Automatisierung. Einerseits kommen 96-Well-Platten in Betracht, die sich mit den unterschiedlichen SPE-Plattformen abarbeiten lassen ¸ andererseits gibt es für 1- und 3-ml-Standardformate Probenvorbereitungssysteme von Gilson (Aspec) und Caliper Life Sciences (Rapidtrace). Auch Gerstel und Zinsser Analytic bieten entsprechend automatisierte Festphasen- Extraktionssysteme an. Säulenschaltung ist eine weitere Alternative, kann aber bei erheblicher Matrixbelastung und mangelhaften Spülroutinen das Problem der Verschleppung mit sich bringen. In diesen Fällen sei auf die Symbiosis Produktfamilie von Spark Holland verwiesen, die mit einzelnen Kartuschen im 96-er Tray online arbeiten und sich unmittelbar mit der Massenspektrometrie hard- und softwaremäßig koppeln lässt. Abschließend soll festgehalten werden, dass die SPE – vor allem, wenn in Substanzklassen fraktioniert wird – im Vergleich zu Proteinfällung und Flüssig- Flüssig-Extraktion die beste Abreicherung der Matrix von Störsubstanzen ermöglicht. Jedoch muss jeder Anwender selbst entscheiden, ob dieser Mehraufwand an Kosten für die Verbrauchsmaterialien und Validierungs- und Zertifizierungsschritte sich lohnt.

Literatur:
[1] Jan Piet Franke, Rokus A. de Zeeuw, J. Chromatogr. B, 713 (1998), 51–59

Stichwörter:
Analytik, Chromatographie, Therapeutisches Drug Monitoring, TDM, LC/MS

L&M 5 / 2007

Diese Artikel wurden veröffentlicht in Ausgabe L&M 5 / 2007.
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