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THC-Metaboliten im Urin

Hoher Durchsatz mit dem ISQ Single Quadrupole GC/MS-System

Datensicherheit hat in der forensischen Toxikologie einen hohen Stellenwert. Daher müssen neue Geräte vor der Analyse von Kundenproben gründlich getestet werden. Zu den kritischen Parametern, die getestet werden, gehören die Genauigkeit über einen weiten dynamischen Bereich, die Präzision und die Genauigkeit bei physiologischen Wirkstoffkonzentrationen sowie die Robustheit des Instruments, auch bei Verwendung großer Volumina biologischer Flüssigkeiten. Aufgrund des üblicherweise hohen Probenaufkommens, das wenig Zeit für Gerätewartung lässt, hat letzterer Punkt eine zentrale Bedeutung für moderne forensische Toxikologie-Laboratorien.

Im Hinblick auf diese Erwägungen wurde das kürzlich eingeführte Thermo Scientific ISQ™ Single Quadrupole GC/MS-System eingehend auf seine Linearität, Genauigkeit, Präzision und Robustheit getestet. Als Prüfsubstanz wurde 11-Nor-9-carboxy-?9- tetrahydrocannabinol (THCA) in einerUrinmatrix gewählt. Aufgrund des hohen Anteils an positiven Testergebnissen für THC müssen viele forensische Toxikologie-Labore große Probenmengen bewältigen [1]. Diese Methode wurde am ISQ GC/MS auf Grundlage der Richtlinien validiert, die von der United States Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA), dem College of American Pathologists (CAP), der Society of Forensic Toxicologists (SOFT) und der European Workplace Drug Testing Society (EWDTS) veröffentlicht wurden. Die Methodenvalidierung wurde unter Verwendung extrahierter und derivatisierter Urinproben ausgeführt und umfasste Linearität, Verschleppung, Präzision innerhalb eines Tages, Tag-zu-Tag-Präzision sowie Robustheit.

Methoden

Die Methodenparameter für die Probenvorbereitung und die instrumentelle Analyse waren identisch mit den zuvor an dem Thermo Scientific DSQ II™ GC/MS-System entwickelten Parametern [2]. Alle Validierungen wurden mit einem Probevolumen von 3 ml Urin durchgeführt. Die Derivatisierung des Urins erfolgte unter Verwendung von Thermo Scientific BSTFA mit 1 % TMCS (Bestell-Nr.: TS–38834). Zur Probenextraktion wurden Thermo Scientific HyperSep ™ Verify-CX Festphasenextraktions- Säulen (200 mg, 10 mL, Bestell-Nr.: 60108–742) eingesetzt. Als interner Standard wurde THCA-D9 eingesetzt. Alle Chargen, einschließlich der Probenserie zur Bestimmung der Robustheit, enthielten eine Ein-Punkt-Kalibrierprobe in Matrix (bei 15 ng/mL). Weiterhin waren Proben für die Qualitätskontrolle mit THCA-Konzentrationen bei 40 % und 125% des Kalibrators (entspricht 6 ng/mL bzw. 18,75 ng/ml), sowie eine Negativkontrolle aus blindwertfreiem Urin mit THCA-D9 enthalten. Die Probenserien zur Bestimmung der Robustheit bestanden jeweils aus 50 Injektionen von Urinextrakten, welche mit dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt worden waren, sowie der Kalibrierproben und der Qualitätskontrollen zur Überprüfung der Systemeignung. Täglich wurde ein vollständiges Autotune durchgeführt, und die entsprechenden Tuning-Berichte wurden auf die Konformität mit einschlägigen Branchenrichtlinien überprüft. Hierbei wurden die Peakformen und die wichtigsten Isotopenverhältnisse des Kalibriergases (PFTBA), die Detektorverstärkung sowie der Luft- und Wasseruntergrund berücksichtigt.
Am ISQ-Massenspektrometer wurde der Modus „Selected Ion Monitoring“ (SIM) eingesetzt. Es wurden jeweils drei Ionen für die Prüfsubstanz THCA sowie zwei Ionen für THCA-D9 gemessen. Die chromatografische Trennung der Proben erfolgte auf einem TRACE GC Ultra™, der mit Split/Splitlos-Injektor und AS3000 II Autosampler ausgestattet war. Der Gaschromatograph wurde mit der für den hohen Durchsatz erforderlichen „Fast-GC“ betrieben. Um die Trennung des THCA-Metaboliten von den Matrixbestandteilen zu optimieren, wurde als Trennsäule eine TRACE™
TR-DoA35, 15 m x 0,20mm i.d. x 0,33 ?m eingesetzt. Die automatisierte Aufnahme und Auswertung sämtlicher Daten, einschließlich der quantitativen Berechnung und Bestimmung der Ionenverhältnisse wurde mit Hilfe der Software ToxLab™ Forms durchgeführt. Die Probenserien wurden sowohl qualitativ als auch quantitativ auf Linearität, Genauigkeit und Robustheit überprüft, um die Konformität mit den Kriterien der Qualitätskontrolle entsprechend den Vorgaben der Akkreditierungsstellen zu bestätigen. Für sämtliche Qualitätskontrollen einer Charge waren die quantitativen Ergebnisse im Rahmen von ± 20 % der erwarteten (theoretischen) Konzentration gefordert. Darüber hinaus war für die Qualifier-Ionen von THCA und THCA-D9 eine Übereinstimmung der Ionenverhältnisse von ± 20 % im Vergleich zu einer 15 ng/mL- Kalibrierprobe vorgeschrieben. Auch die Stabilität der Retentionszeiten wurde beurteilt, wobei die Retentionszeiten der Analyten im Vergleich zur Kalibrierprobe um ± 2 % einzuhalten waren. Die Bestimmung der Ionenverhältnisse, die Überprüfung der Retentionszeiten und die Einhaltung der Qualitätskontroll-Kriterien wurden mit Hilfe der Software ToxLab Forms automatisch im Rahmen der Datenaufnahme und -verarbeitung erfasst. Für die Bestimmung der Präzision war ein Variationskoeffizient von <10 % einzuhalten, wobei auch die Tag-zu-Tag Abweichungen zwischen den berechneten Mengen 10 % nicht überschreiten durften.

Ergebnisse

Linearität von 1,5 ng/ml bis 3000 ng/ml (Abb. 1)

THCA Bestimmungsgrenze bei 1,5 ng/ml (Abb. 2)

THCA Retentionszeit von 1,8 Minuten und GC-Zykluszeit von 5,65 Minuten (entspricht ca 11 Proben pro Stunde)

Präzision innerhalb einer Probenserie und Präzision zwischen verschiedenen Probenserien < 4 % VK (Variationskoeffizient) bei 6 ng/ml und 18,75 ng/ml

Stabiles Geräte-Tuning und alle Qualitätskontrollen innerhalb der Grenzen bei der Messung von 5000 Urinproben, ohne dass Wartungsarbeiten am Massenspektrometer durchgeführt werden mussten

Fazit

Linearität, Präzision und Robustheit einer Nachweismethode für 11-Nor-9-carboxy-?9-tetrahydrocannabinol in einer Urinmatrix wurden unter Verwendung eines ISQ Single Quadrupole GC/MSSystems unter Einhaltung der Kriterien zur Methodenvalidierung von SAMHSA, CAP, SOFT und EWDTS validiert. Der lineare Bereich lag zwischen 1,5 ng/ml und 3000 ng/ml. Verschleppungseffekte konnten in diesem Bereich nicht nachgewiesen werden. Dabei betrug der Variationskoeffizient für die Präzision innerhalb einer Probenserie und zwischen verschiedenen Probenserien weniger
als 4 % bei Konzentrationen von 6 ng/ml und 18,75 ng/ml. Abschließend wurde die Robustheit der Methode am ISQ nach 5000 Injektionen extrahierten Urins nachgewiesen. Sämtliche Qualitätskontrollen wurden bestanden.

klaus.schrickel@thermofisher.com

Literatur
[1] Drug Testing Index. (2009, Mai). Quest Diagnostics, Inc.
[2] High-Throughput GC/MS Confirmation and Quantitation of a THC Metabolite in Urine Using the DS
Note 10161.