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Schnellere Proteintrennung in einer neuen High-Resolution Glassäule

von Katrin Schubert, Dr. Markus Fuchs

Semi-präparative Glassäulen sind für verschiedene Applikationen in der Biochromatografie oder auf anderen Gebieten wie der Gel-Permeations-Chromatografie weit verbreitet, da das Glas biokompatibel und weitgehend chemisch inert und das Gelbett immer sichtbar ist. Mit der Kombination aus einem druckstabilen, quervernetzten chromatografischen Agarosegel und einer druckresistenten High-Resolution Glassäule mit axialer Kompression kann die Trennleistung und -geschwindigkeit für viele Applikationen deutlich verbessert werden.

Das Füllen von Säulen in der Biochromatografie ist eine anspruchsvolle Aufgabe, die recht zeitaufwändig ist und großen Einfluss auf die Qualität der Trennung hat. Das Füllen einer semi-präparativen Glassäule benötigt bisher nicht selten einen ganzen Arbeitstag. Mit der Möglichkeit, den Packvorgang bei höherem Druck auszuführen, kann hierbei massiv Zeit eingespart werden. In diesem Artikel wird der Einfluss des Packens der Biochromatografie-Säulen mit unterschiedlichem Fülldruck auf die Trennleistung der resultierenden Säulen untersucht. Schließlich werden anhand des Beispiels einer Trennung von populären Markerproteinen die Vorteile der unter erhöhtem Druck gefüllten Glassäulen für die Biochromatografie-Praxis demonstriert.

Experimentelles

Für alle Versuche wurden Bioline HR Säulen mit den Abmessungen 20 mm ID x 60 cm Länge verwendet. Die benetzten Teile dieser biokompatiblen Säule bestehen aus PEEK, PTFE und Borosilikatglas. Der Fülltrichter besteht aus Methacrylatpolymer. Das Glasrohr kann bis zu 100 bar (10 Mpa) sicher eingesetzt werden. Als chromatografisches Agarosegel wurde Biofox 40 SEC gewählt, das in einem speziellen Crosslinking-Verfahren hergestellt wird und eine hochporöse und physikalisch stabile Agarose-Matrix mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 40 ?m aufweist. Die Flussrate beim Füllen betrug 3 – 15 ml/min.
Für die Füllung bei Atmosphärendruck (1 bar; 0,1 Mpa) wurde die Flussgeschwindigkeit verlangsamt bis der Druckanzeiger „0“ zeigte. Alle Versuche wurden auf einem KNAUER Bioline LC System durchgeführt. Die Qualität des Packergebnisses wurde über einen häufig eingesetzten Leistungstest (Acetontest, [4]) beurteilt. Für den Praxistest wurde ein Gemisch aus Albumin und Myoglobin unter verschiedenen Fluss- und Druckbedingungen auf einer per Überdruck gepackten High-Resolution Glassäule getrennt. Der Fülldruck entsprach dem zuvor in den Versuchsreihen
ermittelten Optimum.

Ergebnisse

1. Durch die Befüllung der Glassäulen mit stationärer Phase unter erhöhtem Druck lässt sich die für das Packen benötigte Zeit drastisch verkürzen. Verglichen mit dem Füllen bei Atmosphärendruck verringert sich die benötigte Zeit von 12 auf etwa 2 Stunden, d.h. um Faktor 6.

2. Die Trennergebnisse solchermaßen gefüllter Säulen waren mindestens genauso gut, wie mit Säulen, die bei Atmosphärendruck gepackt wurden. Vielmehr zeigten die Untersuchungen, dass sich die Trennleistung (Zahl theoretischer Böden) von Säulen mit einem Fülldruck zwischen 10 und max. 15 bar dabei deutlich verbesserte.
Die Steigerung lag bei Faktor 2,3.

3. Die Untersuchungen zeigten für das eingesetzte Biofox 40 SEC Agarosegel ein Optimum der Trennung, wenn die Säule mit 15 bar (1,5 MPa) Druck befüllt wurde. Bei weiter erhöhtem Druck wurde dagegen wieder eine Verschlechterung der Trennleistung beobachtet.

4. Das Biochromatografie-Beispiel mit Albumin und Myoglobin zeigt, dass wegen der hohen Auflösung der mit Biofox SEC hochdruckgefüllten Glassäule sich die Trennung durch Erhöhung der Flussrate und damit erhöhtem Betriebsdruck in etwa einem Drittel der üblicherweise benötigten Zeit durchführen lässt.

Fazit

Die Kombination von modernen stabilen Biochromatografie-Medien mit druckfesten Glassäulen erweitert die chromatografischen Möglichkeiten und die Spielräume in Richtung höher aufgelöster oder beschleunigter Trennungen für den Anwender. Am interessantesten dürfte wohl die Beschleunigung von Reinigungsschritten sein. Nicht zu unterschätzen ist jedoch auch der Zeitgewinn beim Füllen der Säulen mit Überdruck und die sichere Handhabung der Bioline HR Glassäulen. Eine Besonderheit dieser Glassäulen ist der integrierte Temperiermantel zum Anschluss an einen Flüssigkeitsthermostaten.

Literatur

[1] MPLC Glassäulen, KNAUER Benutzerhandbuch, Berlin 2009
[2] Schubert K. et al.: High Pressure Filling and Operation of a new type of Glass Columns for Biochromatography, KNAUER Poster ESBES Bologna, 2010
[3] Chromatogramm mit freundlicher Genehmigung von Bio-Works AB, Schweden
[4] GE Healthcare Sepharose Instruction Manual, Uppsala, 2008

www.knauer.net