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SEC - Größenausschluss-Chromatographie zur Reinigung von Biomolekülen

Die Größenausschluss-Chromatographie (SEC von engl. size-exclusion chromatography) dient der Trennung von Biomolekülen nach ihrer Größe. Diese Technik wird vor allem zur Trennung von Biopolymeren wie Proteinen und Nukleinsäuren, also wasserlöslichen Poly- meren, eingesetzt. Typischerweise dienen kugelförmige Partikel aus Dextran oder Agar- ose als Matrixsubstanz. Das System wird auch als Gelfiltration bezeichnet. Kleinere Moleküle wandern signifikant schneller durch die Matrix als große Moleküle. Diese Technik ist nicht mit der Gel-Elektrophorese zu verwechseln, da große Unterschiede im Separationsprinzip bestehen. SEC braucht keinen elektrischen Strom und der Siebeffekt trennt kleine Moleküle nicht zuerst ab.

Es besteht ein direkter Zusammenhang zwischen Molekularmasse und Wanderungs-geschwindigkeit in der Gel-Matrix. Kleinere Moleküle wandern deutlich langsamer durch die Gelmatrix der Säule als größere Moleküle. Die kleineren Moleküle können in die Poren der Matrix-Partikel eintreten, was eine längere Laufstrecke und längere Retentionszeit bedingt. Umgekehrt wandern die größeren Moleküle entsprechend schneller durch die Matrix, da sie nicht in die Poren eindringen können. Dieser molekulare Siebeffekt darf nicht mit dem der Gel-Elektrophorese verwechselt werden, wo größere Moleküle langsamer im elektrischen Feld wandern, da sie von der Matrixsubstanz länger zurückgehalten werden.

Vorteile der SEC / Gelfiltration

Die Trennung von Molekülen in der SEC nur aufgrund ihrer Größe ist sehr effektiv und ver- läuft meistens bei milden chemischen Bedingungen. Dies bedeutet, dass die Aktivität von Biomolekülen erhalten bleibt. Da das Säulenmaterial hohe chemische Stabilität auf- weist, können zum Beispiel auch Lösungen von Harnstoff, SDS, Essigsäure, Salzsäure, Ethanol, Propanol oder Acetonitril verwendet werden. Die Ausbeute einer Aufreinigung mit der SEC liegt meistens bei über 90%. Anders als beispielsweise mit der Dialyse kann das Proben-volumen in der SEC gering gehalten werden. Damit ist die Technik auch für konzentrierte Proben gut geeignet.

Die Matrix

AppliChems Säulen für die Größenausschluss-Chromatographie sind mit AppliXchange-G25M gepackt, einer kugelförmigen Matrixsubstanz, die zum Teil aus polymerisiertem Dextran aufgebaut ist. Sie ermöglicht hohe Selektivität, hohe Auflösung
und chemische Stabilität. Moleküle werden auf AppliXchange-G25M allein auf Grund ihrer Größe getrennt. Die chemische Interaktion zwischen Gel-Matrix und zu trennenden Molekülen ist vernachlässigbar. Es findet wenig oder keine Absorption oder Bindung statt. Puffereffekte oder pH-Einflüsse werden minimal gehalten. Daher können Pufferbedingungen, pH-Wert und Temperatur während der Gelfiltration den Bedürfnissen der zu trennenden Moleküle angepasst werden und müssen sich nicht nach den Eigenschaften des Säulenmaterials richten. Auch Kofaktoren oder Ionen, die für Funktion und Stabilität von
Proteinen benötigt werden, können dem Probenpuffer zugesetzt werden, da sie die Trennung kaum beeinflussen. Der Cut-Off bei Größenausschluss-Chromatographie mit AppliXchange-G25M liegt für Proteine bei 10 kD und für Nukleinsäuren bei 10 bp.
Nach unserer Erfahrung können diese Säulen bis zu viermal wieder verwendet werden. Dafür ist es wichtig nach einer Reinigung zusätzliche Waschschritte mit Elutionspuffer durchzuführen, um verbliebene Molekülreste zu entfernen.

Bei AppliXchange-G25M steht „25“ für das Wasseraufnahmevermögen der Matrix. „25“ bedeutet, dass die trockene Matrixsubstanz das 2,5-fache seiner Masse an Wasser aufnimmt (1 g AppliXchange-G25M bindet 2,5 g Wasser). Die Fähigkeit Wasser zu absorbieren ist vom Ausmaß der Vernetzung der Matrix abhängig. Eine engere Vernetzung begrenzt die Fähigkeit der Matrixpartikel zu quellen. Ein geringerer Vernetzungsgrad führt zu höherer Flexibilität der Partikel und höherem Quellvermögen. Der Vernetzungsgrad von AppliXchange wurde für höchste Trennleistungen optimiert. Das Wasseraufnahmevermögen / der Vernetzungsgrad bedingt unmittelbar die Trennleistung in der Chromatographie: geringe Vernetzung führt zu größeren Poren, welche wiederum größere Moleküle zurückhalten, während ein hoher Vernetzungsgrad kleine Poren ausbildet, welche nur sehr
kleine Moleküle zurückhält. Schließlich ist die Gelfiltration von folgenden Parametern
abhängig: eingesetztes AppliXchange, Durchflussrate, Säulendurchmesser, Säulenlänge, Elutionspuffer und den Größenunterschieden der zu trennenden Komponenten der Probe.
Die Bezeichnungen superfine, fine, medium und coarse (‚grob‘) beschreiben die durchschnittliche Partikelgröße. Superfine bezeichnet 20 – 50 µm Durchmesser,
fine 20 – 80 µm, medium 50 – 150 µm und coarse 150 – 200 µm; dabei liegen 80 % der Partikel im angegebenen Größenbereich. Der mittlere Durchmesser beeinflusst wesentlich die Durchflussrate des Mediums. Für Mikrotiter-Platten finden üblicherweise Partikel der Gruppe superfine Anwendung. In Zentrifugen-Säulchen werden superfine oder fine Partikel eingesetzt. Kleinere Gravitations-Durchfluss-Säulen verwenden medium Partikel und
größere Säulen medium oder coarse.

DextraSEC – Säulen und Platten

Die AppliXchange-G25 M Matrix ist nun auch in gebrauchsfertigen Säulen oder als Platten im 96-well Format als DextraSEC-Produkte erhältlich. Die Abkürzungen NA, PRO und 96W im Namen bezeichnen die bevorzugten Einsatzbereiche:

NA für Nukleinsäuren (nucleic acids), PRO für Protein und 96W für 96-well-Platten.

DextraSEC NA zur Aufreiningung von Nukleinsäuren dient etwa zur Entsalzung
von Oligonukleotiden oder um überschüssigen Farbstoff nach einer Markierungsreaktion
abzutrennen. Um befriedigende Ausbeuten von Oligonukleotiden zu erhalten, sollten diese mindestens 10 bp groß sein.

DextraSEC PRO Säulen werden zur Protein-Aufreinigung oder -Entsalzung verwendet.
Mit DextraSEC PRO Säulen werden Proteine von kleineren Molekülen wie Farbstoffen, Salzen, Hapten, Biotin und vielen weiteren gereingt. Das Säulenformat hat bemerkenswerte Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden wie etwa der Dialyse. Der Zeitaufwand mit DextraSEC-Säulen ist minimal und die Proben werden nicht oder nur wenig im Eluat verdünnt. Für beste Trennleistungen sollten die Proteine Molekularmassen von mindestens 10 kDa aufweisen.

DextraSEC 96W sind Mikrotiter-Platten im 96-well Format. Sie sind besonders für die Aufreinigung von DNA-Sequenzierungsreaktionen im Hochdurchsatzverfahren optimiert. Überschüssiges DyeDeoxy und BigDye werden effektiv und verlässlich abgetrennt – für beste Sequenzierungensergebnisse.
Weitere Anwendungen sind beispielsweise die Entfernung von Phenolresten oder von überschüssigen Nukleotiden, markierten dNTPs und kleinen PCR-Primern.

Die Säulen DextraSEC NA2 (für Nukleinsäuren) und DextraSEC PRO2 (für Proteine)
sind für Probenvolumen 150 – 200 ?l ausgelegt. Die größeren Säulen DextraSEC NA10 (für Nukleinsäuren) und DextraSEC PRO10 (für Proteine) sind für Probenvolumen 0,5 – 1 ml ausgelegt. Das maximale Probenvolumen unserer DextraSEC 96W Platten beträgt 15 ?l pro Vertiefung.

Stabilität der Matrix

Das Problem ist das Wachstum unerwünschter, mikrobiologischer Keime und nicht ein physikalisches Problem assoziiert mit AppliXchange. Die hydratisierte Matrix kann bei Raumtemperatur unbegrenzt gelagert werden, wenn sie in Gegenwart eines Konservierungsmittels hydratisiert wird. Als solche dienen Natriumazid, Thimerosal oder andere kommerziell erhältliche Biozide. Wir verwenden Proclin(R) 300.
Wenn die AppliXchange-Matrix mit Wasser oder, noch schlimmer, in PBS ohne Konservierungsmittel hydratisiert wird, kann unter Umständen signifikantes und sichtbares bakterielles oder Pilzwachstum beobachtet werden. Das Auftreten hängt zum Beispiel von folgenden Konditionen, unter denen / in denen AppliXchange hydratisiert wird, ab: der Reinheit der benutzten Gefäße, der Wasserreinheit oder der der Puffer. Da dies alles unkontrollierbare Bedingungen sind, empfehlen wir rehydratisiertes AppliXchange-G25 M (ohne Zusatz von Konservierungsstoffen) nicht länger als eine Woche bei 2 – 8°C zu lagern.
Wir haben hydratisiertes AppliXchange-G25 M unter Verwendung sehr sauberer Glasgeräte, hoch-reinem und sterilem Wasser (keine Phosphate, d.h. PBS! Diese fungieren als „Düngemittel“!!) für über 6 Wochen bei +6°C gelagert, ohne jegliche Bio-Kontamination zu beobachten. Selbiges konnten wir für 2 – 3 Tage (Wochenende) bei Raumtemperatur ohne Probleme lagern.

Überladen

„Ladung“ kann sich sowohl auf das Probenvolumen als auch auf die Konzentration beziehen. Schon zuviel von jeweils einem Parameter wird zur Überladung der Säule führen. Diese unsachgemäße Benutzung kann einfach durch Reduzierung der Beladung korrigiert werden. NICHT mehr Volumen als empfohlen laden und NICHT unverhältnismäßig höhere Konzentrationen an Verunreinigungen und/oder Molekülen, die gereinigt werden sollen, laden. Dies wird zu einer nicht zufriedenstellenden Reinigung führen. Wenn Sie eine exakt definierte Anwendung planen, können wir bei Bedarf Hilfestellung bei der Bestimmung der maximal möglichen Konzentration und des Probenvolumes geben. Ansonsten müssen Sie die speziellen Parameter für Ihre eigene Anwendung bestimmen.

Anleitung zum Hydratisieren der Säulenmatrix

AppliXchange-G25 M wird als trockenes Pulver geliefert. Vor Anwendung muss es hydratisiert werden. AppliXchange während der Hydratisierung nicht übermäßig rühren, weil dies die Kügelchen schädigt. Keinen Magnetrührer verwenden. Die AppliXchange-G25 M Matrix wird pro Gramm auf ca. 5 ml Volumen anschwellen.
Grundregel: 6,5 bis 10 ml Hydratisierungspuffer oder Wasser pro Gramm AppliXchange-G25 M verwenden.
Wählen Sie das Säulenbettvolumen, das Sie für Ihre Anwendung brauchen, bestimmen Sie die Grammzahl an benötigtem AppliXchange-G25 M und das erforderliche
Volumen an Hydratisierungspuffer oder Wasser.
AppliXchange-G25 M wird bei Raumtemperatur für 3 Stunden oder für 1 Stunde bei 90°C hydratisiert. Hydratisiertes AppliXchange-G25 M kann bei neutralem pH-Wert durch Autoklavieren für 30 Minuten bei 120°C sterilisiert werden. Beste Ergebnisse werden erzielt, wenn die hydratisierte Matrix vorher entgast wird. Falls eine Wiederverwendung der Matrix geplant ist, kann das hydratisierte Gel mit 2 Säulenvolumina 0,2 M NaOH gewaschen werden. Anschließend mit 2 Säulenvolumina Wasser nachwaschen und mit 2 – 3 Säulenvolumina Puffer re-äquilibrieren.

Antimikrobielle Zusätze sollten für die Lagerung zur Suspension zugegeben werden
(0,001 % Phenylquecksilber-Salze; 0,005 % Thimerosal; 0,05 % Chlorbutanol;
0,002 % Chlorhexin; 0,02 % Natriumazid oder 20 % Ethanol sind akzeptabel).
Hydratisiertes AppliXchange-G25 kann bei Raumtemperatur (mit Konservierungsstoff!)
oder bei +2 bis +4°C gelagert werden. Nicht einfrieren! Das Gel vor
Gebrauch auf Umgebungstemperatur einstellen lassen.

Hohe Leistung

• über 90 % Ausbeute
• einfache Handhabung
• hohe chemische Stabilität
• hohe Auflösung

Stichwörter:
SEC, Größenausschlusschromatographie, Gelfiltrationsmatrix, polymerisiertes Dextran, Entsalzung, Pufferwechsel, Nukleinsäure-/Protein-Reinigung

L&M 4 / 2009

Diese Artikel wurden veröffentlicht in Ausgabe L&M 4 / 2009.
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