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HPTLC in der Trinkwasseranalytik

Analyse von organischen Substanzen in Wasser

von Wolfgang Schulz, Dr. Walter H. Weber

Die Tatsache, dass wir täglich mit Wasser zu tun haben, erfordert eine umfassende Überwachung sowohl des Trinkwassers als auch der aquatischen Umwelt. Nur so ist eine hohe Trinkwasserqualität sicherzustellen. Heute sind mehrere Millionen von -chemischen Verbindungen bekannt, wovon viele als Umweltschadstoffe angesehen -werden können. Die Einzelstoffanalytik ist aufgrund der großen Anzahl an Schadstoffen mit der Überwachung von Umwelt- und Wasser-proben häufig überfordert [1].

Es ist zwar möglich, mithilfe von physikalisch-chemischen Analysetechniken wie der Gaschromatographie (GC) oder der Flüssigkeitschromatographie (LC) – gekoppelt mit der Massenspektrometrie (MS) – bis zu einigen hundert Verbindungen simultan zu untersuchen. Dennoch können mit diesen Verfahren lediglich Substanzen detektiert werden, die gezielt gesucht werden. Bisher noch unbekannte Substanzen oder Transformationsprodukte werden nicht erfasst.

Eine Alternative stellt das Screening unter Verwendung der Planar-Chromatographie dar, insbesondere bei Einsatz der HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography). Die planare Chromatographie ermöglicht die Analyse von vielen organischen Substanzen. Durch den Einsatz der Mehrfachentwicklung, der so genannten „Automated Multiple Development“ (AMD)-Technik mit Gradienten-elution, können komplexe Gemische aus polaren und -unpolaren Substanzen effektiv getrennt werden. Verschiedene Detektionsverfahren lassen sich in der Planar-Chromatographie einsetzen.

Organische Substanzen können beispielsweise durch Fluoreszenzlöschung erkannt werden. Zum Einsatz kommt hierbei ein Fluoreszenzindikator, der auf der TLC-Schicht gebunden ist und bei einer Wellenlänge von 254 nm angeregt wird. Des Weiteren ist es möglich, Verbindungen aufgrund ihrer Eigenfluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 366 nm nachzuweisen.
Diese beiden Nachweismöglichkeiten geben auf eine einfache und zeitsparende Weise einen ersten Eindruck von der zu untersuchenden Probe.

Für eine umfassende Analyse, mit der Möglichkeit der quantitativen Auswertung, kann ein Scanner zur Messung der Absorption im UV/Vis-Bereich bzw. der Messung der Fluoreszenz eingesetzt werden. Zudem lässt sich das Vorhandensein verschiedener funktioneller Gruppen durch Derivatisierungen auf der TLC-Platte nachweisen. So sind beispielsweise Carbonylverbindungen, nach der Reaktion mit 2,4-Dinitro-Phenylhydrazin (2,4-DNPH), als gelb bis orange-rote Banden zu erkennen [2].
Darüber hinaus können biologische Testverfahren zur Detektion angewendet werden.

Auf diese Weise ist es möglich, Substanzen wirkungsbezogen zu analysieren (wirkungsbezogene Analytik, WBA). Die Kombination der planaren Chromatographie mit dem Leuchtbakterientest (Vibrio fischeri) hat sich als besonders effektiv erwiesen [4-9].
Hierbei wird die entwickelte TLC-Platte in eine Leuchtbakteriensuspension getaucht und anschließend wird das in einer Dunkelkammer von den Bakterien emittierte Licht durch eine CCD-Kamera detektiert. Die Substanzbanden, die eine toxische Wirkung auf den Stoffwechsel der Leuchtbakterien besitzen, erscheinen als dunkle Banden im digitalen Bild.

Zudem können Substanzen aus einzelnen Banden der Massenspektrometrie (MS) durch Extraktion von der Platte mittels eines TLC-MS Interfaces (Camag, Schweiz) zugänglich gemacht werden [10]. Beispielsweise kann durch die Verwendung eines Quadrupol-Flugzeitmassenspektrometers (QTOF-MS) (Agilent Technologies, USA), anhand der exakten Masse die Summenformel der Verbindung ermittelt werden.
Im Betriebs- und Forschungslabor des Zweckverbands Landeswasserversorgung werden die genannten Verfahren und deren Kombinationen eingesetzt, um eine umfassende und vorausschauende Überwachung der Roh- und Trinkwasser zu gewährleisten.

Potenziell umweltrelevante Verbindungen werden unter anderem über Autobahnabwässer in die aquatische Umwelt eingetragen. Zur Untersuchung des Abwassereintrags von der Autobahn wurde ein Regenrückhaltebecken beprobt.
Die Anreicherung erfolgte mittels Festphasen-Extraktion bei pH = 7 um den Faktor 5000. Es wurden von der Probe 2 µL auf die HPTLC-Platte aufgetragen und mit einem mehrstufigen Gradienten, bestehend aus Methanol, Dichlormethan und n-Hexan, entwickelt.

Bei der Betrachtung der entwickelten Platte unter dem UV-Licht bei 254 nm bzw. 366 nm sind deutlich mehrere Banden zu erkennen. Nach dem Tauchen der Platte in eine Leuchtbakteriensuspension wird deutlich, dass die meisten bioaktiven Substanzen sich im mittleren Rf-Bereich befinden. Um Carbonylverbindungen zu detektieren, wurde eine weitere Platte unter gleichen Bedingungen entwickelt und in eine schwefelsaure 2,4-DNPH-Lösung getaucht. Die auf den Nachweis positiv reagierenden Banden verfärbten sich orange (Abb. 1).

Abb. 1: Vergleich der verschiedenen Detektionsmöglichkeiten
Für eine weitere Untersuchung der UV-Absorption wurde ein Mehrwellenlängenscan über die Entwicklungsbahn der Probe aufgenommen. Hierbei wird die unterschiedliche Absorption, bei verschiedenen Wellenlängen, der einzelnen Banden sichtbar (Abb. 2).

Abb. 2: Mehrwellenlängenscan (190 bis 300 nm) der Probenbahn

Zur weiteren Untersuchung wird die in Abb. 1 orange umrahmte Bande des Chromato- gramms mithilfe eines TLC-MS Interface von der Platte extrahiert und einem QTOF-MS zugeführt. Hierzu wird die HPTLC-Platte mithilfe eines Koordinatensystems auf dem Interface positioniert und ein mit Druckluft betriebener Stempel wird auf die Platte gepresst. Mittels einer HPLC-Pumpe wird ein Eluent durch den Stempel geleitet, extrahiert dabei
die sich auf der Platte befindliche Substanz und transferiert diese ins MS. Die Elektrospray-Ionisation erfolgte im positiven Modus. Anhand der Messung der exakten Masse und des Isotopenmusters konnte der Verbindung die Summenformel C11H18N6O3 zugeordnet
werden (Abb. 3). Da die extrahierte Bande eine positive Reaktion mit 2,4-DNPH zeigt, lassen sich die möglichen Strukturformeln bei einer Datenbankabfrage auf Carbonyl-verbindungen beschränken.

Abb. 3: TLC-MS-Messung mittels TOF-MS

Zusammenfassung

Bei der planaren Chromatographie handelt es sich um ein offenes System, deshalb können verschiedenste Detektionsmöglichkeiten nach der Trennung angewandt werden. Neben der Messung der UV/ViS-Absorption über die einzelnen Probenbahnen, kann die Probe auch wirkungsbezogen auf der Platte analysiert werden. So ist es möglich, bei einem Screening mit der HPTLC biologisch aktive Substanzen zu erkennen. Für die weitere Untersuchung der relevanten Banden, können diese einem MS zugeführt werden. Zusätzlich lassen sich durch Derivatisierungsreaktionen auf der Platte weitere Strukturinformationen gewinnen.

Literatur:
[1] C. Weins, M. Oehme, Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit 2006, 1, 1.
[2] H. Jork, W. Funk, W. Fischer, H. Wimmer, Dünnschichtchromatographie Band 1a 1989, 273.
[3] G. Eberz, H.-G. Rast, K. Burger, W. Kreiss, C. Weisemann, Chromatographia 1996, 43, 5.
[4] C. Weins,H. Jork, J. Chromatogr. A 1996, 750, 403.
[5] W.H. Weber, W. Seitz, A. Aichinger, R. Albert, CAMAG Bibliography Service 2005, 94, 2.
[6] N. Bieg, W. Seitz, W. Schulz, W.H. Weber, 72. Jahrestagungder Wasserchemischen Gesellschaft, Fachgruppe in der GDCh – Kurzreferate 2006.
[7] S.M. Verbitski, G.T. Gourdin, L.M. Ikenouye, J.D. McChesney, American Biotechnology Laboratory 2006, 24, 40.
[8] W. Schulz, W. Seitz, S.C. Weiss, W.H. Weber, M. Böhm, D. Flottmann, J. Planar Chromatogr. 2008, 21, 427.
[9] S.C. Weiss, W. Schulz, W.H. Weber, Neue Auswertemethode der Biolumineszenzhemmung von Vibrio fischeri in der Kombination mit der Planarchromatographie, Tagungsbandbeitrag ANAKON 2009.
[10] H. Luftmann, M. Aranda, G. Morlock, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2007, 21, 3772.